Meccanismi di liberazione dei neurotrasmettitori

I neurotrasmettitori sono liberati all’interno di specifiche vescicole nella fessura sinaptica per esocitosi. In tale processo il Ca (calcio) sembra avere un ruolo cruciale influenzando la probabilità di rilascio di un quanto di Neurotrasmettitore.

 

Il potenziale di azione insorge come conseguenza dell’apertura di canali Na voltaggio dipendenti che genera un flusso di Na verso l’interno del neurone e dal’apertura di canali K voltaggio dipendenti che invece genera un flusso di K verso l’esterno del neurone. Per verificare il contributo degli ioni Na e K alla liberazione dei neurotrasmettitori Katz e Miledi condussero una serie di esperimenti sulla sinapsi gigante del Calamaro. Se si bloccano i canali voltaggio dipendenti Na con tetrodotossina (TTX) , i potenziali di azione presinaptici si riducono progressivamente. Quando il blocco dei canali Na diviene tale da ridurre l’ampiezza del potenziale al di sotto di 40 mV il potenziale sinaptico scompare del tutto. Anche se l’ingresso di Na nella terminazione sinaptica sembra essere necessario per la liberazione del neurotrasmettitore, esso tuttavia non è sufficiente. L’ingresso di Na, perciò, è importante solo in quanto depolarizza la membrana in misura sufficiente affinchè la liberazione dei neurotrasmettitori abbia luogo.

Il candidato successivo a questa funzione è ovviamente il K. Per valutare il suo contributo alla liberazione del neurotrasmettitore si possono bloccare i canali K voltaggio dipendente con tetraetilammonio (TEA) e i canali Na voltaggio dipendente con TTX. Si fa quindi passare una corrente depolarizzante nella terminazione presinaptica; i potenziali sinaptici sono di ampiezza normale, il che sta ad indicare che anche nelle condizioni predette il neurotrasmettitore può venire liberato normalmente. In queste condizioni la liberazione del neurotrasmettitore risulta protratta nel tempo. Perciò, né gli Na né i K che sono ioni responsabili del potenziale di azione sono necessari per la liberazione del neurotrasmettitore

A questo punto Kartz e Miled concentrarono la loro attenzione sul Ca. Già in precedenza Katz aveva osservato che l’aumento di concentrazione extracellulare dei Ca esaltava la liberazione dei neurotrasmettitori Gli autori ipotizzarono che i Ca potessero svolgere due funzioni,  fungere da: a) vettori di scariche analogamente ai Na e K, e b) da messaggeri intracellulari capaci di portare alle strutture responsabili della liberazione dei neurotrasmettitori informazioni relative alle variazioni del potenziale di membrana. In accordo a questa osservazione gli autori osservarono che quando i canali Na e K venivano bloccati con TTX e TEA, depolarizzazioni graduali attivavano una corrente entrante di Ca che determinava a sua volta la liberazione graduale di neurotrasmettitori Questi risultati suggerirono che la depolarizzazione che consegue l’insorgenza di un potenziale di azione determinasse l’apertura di canali Ca voltaggio dipendenti in grado di far aumentare la concentrazione di Ca a livello delle zone attive. Tale aumento sembra un fattore adatto per innescare la liberazione sincrona del neurotrasmettitore Il caratteristico ritardo delle sinapsi chimiche è in gran parte dovuto al tempo impiegato dai canali Ca ad aprirsi. Quanto maggiore è la durata del potenziale di azione tanto maggiore sarà la quantità di ioni Ca che entra nella cellula e tanto più elevate saranno perciò sia le quantità di neurotrasmettitori liberati che l’ampiezza del potenziale postsinaptico.

I neurotrasmettitori vengono liberati in pacchetti unitari detti quanti. Ogni quanto di neurotrasmettitore determina la comparsa di un potenziale postsinaptico costante, detto potenziale sinaptico unitario. Il potenziale globale è composto da un numero finito di questi potenziali unitari.

Katz scopri la natura quantale osservando sinapsi neuromuscolari di rana senza stimolare la terminazione presinaptica. In queste condizioni si osservò la presenza di piccole oscillazioni spontanee di circa 0.5 mV che furono chiamati potenziali di placca in miniatura. In assenza di stimolazione questi potenziali in miniatura si presentano ad intervalli casuali e la loro frequenza può essere aumentata depolarizzando la terminazione sinaptica. Questo tipo di comportamento significa che le terminazioni nervose presinaptiche liberano in maniera continua piccole quantità di Ach. Grazie all’utilizzo della tecnica del patch-clamp è stato possibile effettuare una approssimazione del numero di canali necessari all’insorgenza del potenziale di placca in miniatura; osservando che per raggiungere 0.5 mV è necessaria la depolarizzazione di 2000 canali. Perciò per produrre questo potenziale sono necessarie circa 5000 molecole di Ach (in quanto per aprire un canale sono necessarie 2 molecole di Ach ma nella trasmissione molta Ach viene dispersa o idrolizzata dall’acetilcolinesterasi).

Quando la giunzione neuromuscolare viene incubata in soluzioni a bassa concentrazione di Ca il potenziale di placca evocato si riduce drasticamente. La risposta più piccola che è possibile osservare vale a dire il potenziale unitario ha ampiezza e forma sovrapponibile a quelle dei potenziali in miniatura e tutti i potenziali di placca di ampiezza maggiore di quella del potenziale sinaptico unitario sembrano essere suoi multipli. Queste osservazioni dimostrano che la quantità di Ca non hanno effetto sulle dimensioni del quanto (il numero di molecole di Ach in esso presente) ma bensì sulla probabilità che un quando venga liberato.

Trasmissione chimica-vescicole sinaptiche

Il rilascio delle vescicole sinaptiche nella giunzione sinaptica avviene per mezzo esocitosi.(Fonte)

Le immagini della microscopia elettronica suggerirono agli autori l’ipotesi che le vescicole fossero gli organuli di depositi dei quanti di neurotrasmettitori Essi ipotizzarono che ogni vescicola possedesse un quanto di neurotrasmettitore (pari ad alcune migliaia di molecole) e che ogni vescicola si potesse fondere con la superficie interna della membrana plasmatica della terminazione nervosa a livello di siti specializzati chiamate zone attive.

Le vescicole sinaptiche scaricano all’esterno il proprio contenuto fondendosi con la membrana mediante un processo detto di esocitosi. Per sapere se questi siti sono i soli ad essere coinvolti in questo processo di esocitosi, intorno agli anni 70 molti ricercatori iniziarono ad impiegare metodi di crio-frattura. Questa tecnica ha permesso di fare 3 osservazioni importanti:

  1.  lungo i margini dei filamenti intermembranosi vi sono una o due file di particelle di grandezza inconsueta che potrebbero essere i canali Ca voltaggio dipendenti necessari per la liberazione del neurotrasmettitore.
  2. Nel corso dell’attività sinaptica lungo le file delle particelle intramembrane compaiono delle invaginazioni che potrebbero formarsi a causa del processo di esocitosi.
  3.  Queste invaginazioni non persistono ma sembrano essere transitorie.
Vescicole sinaptiche

Analisi ultra-strutturale di una sinapsi troncoenfalica in un ratto wild-type all’età embrionale di 18.5 giorni. Sono evidenziato con un asterisco le vescicole presinaptiche, la freccia mostra la giunzione sinaptica. Scala bar, 250 nm.(Fonte)

Bloccando i canali K voltaggio dipendenti per prolungare il potenziale di azione è stato possibile concludere che si ha l’esocitosi di una vescicola per ogni quanto di neurotrasmettitore che viene liberato e che quindi le vescicole sono gli organuli nei quali si accumulano i neurotrasmettitori e che l’esocitosi è il meccanismo mediante il quale essi vengono liberati.

 Ad ogni dato tempo solo un numero limitato di vescicole è in realtà, localizzato proprio nelle zone attive; la maggior parte di esse si trovano in vicinanza. Un elevata disponibilità di Ca  si rende necessaria per far si che le vescicole possano raggiungere i siti di liberazione a livello delle zone attive. E’ stato individuato un gruppo di proteine che potrebbero esercitare le funzioni di vincolare le vescicole in modo da impedire una loro mobilitazione casuale, indirizzare le vescicole libere verso le zone attive e facilitare i processi di fusione e esocitosi. Le proteine che si trovano al di fuori delle zone attive non sono libere ma sono vincolate a una rete di filamenti del citoscheletro, si ritiene che siano le sinapsine le proteine che hanno tale compito.

La funzione d’indirizzare il moto delle vescicole verso i siti ancoraggio e di rilascio sembra essere svolta da due fattori Rab3a e Rab3b. Recentemente è stato messo in luce un meccanismo per l’ancoraggio delle vescicole. Quando le vescicole lasciano l’ER (reticolo endoplasmatico) vengono indirizzate verso l’apparato del Golgi racchiuse in vescicole formate dal’ER: Qui le vescicole si fondono con quelle dell’apparato del Golgi. Le vescicole contenenti le proteine mature si staccano ed infine vengono indirizzate verso la superficie cellulare dove vengono liberate per esocitosi.

La membrana delle vescicole si fonde con la membrana della terminazione sinaptica in modo da poter entrare in contatto con gli spazi extracellulari. A questo punto la membrana plasmatica viene rapidamente recuperata e riutilizzata.

Data la notevole correlazione esistente fra liberazione di neurotrasmettitore e concentrazione intracellulare di Ca, i meccanismi del neurone presinaptico che modificano la concentrazione dei Ca liberi nella terminazione modificano anche la quantità di N che viene liberato. La stimolazione del neurone presinaptico a frequenza elevata è detta stimolazione tetanica. L’aumento dell’ampiezza del potenziale postsinaptico che si osserva durante una stimolazione tetanica è detto potenziamento, l’aumento che persiste dopo la cessazione della stimolazione è detto potenziamento post-tetanico, e sembra che dipenda dalla saturazione dei diversi sistemi deputati a tamponare la concentrazione di Ca. Il conseguente aumento dei Ca liberi facilità la trasmissione sinaptica per un periodo di parecchi minuti o più, attivando la protein chinasi Ca/calmodulina-dipendente che mette in moto la cascata di reazioni che mobilizzano le vescicole nelle terminazioni sinaptiche. La protein chinasi Ca/calmodulina dipendente infatti consente lo sviluppo di un numero maggiore di vescicole sinaptiche. Di conseguenza per ogni potenziale di azione che invade le terminazioni nervose si libera molto più neurotrasmettitore che in condizioni normali. Ecco dunque il caso più semplice di memoria cellulare.

Mentre le sinapsi asso-somatiche esercitano la propria influenza su tutte le branche assonali del neurone postsinaptico, le sinapsi asso-assoniche controllano selettivamente l’attività di singole diramazioni neuronali. Una loro attività importante è quella di controllare l’ingresso di ioni Ca nelle terminazioni, aumentando o riducendo la liberazione del neurotrasmettitore

Quando un neurone iperpolarizza il corpo cellulare di un altro neurone esso diminuisce la probabilità che la cellula postsinaptica generi un potenziale di azione. Questo tipo di attività viene detta inibizione postsinaptica. Quando al contrario un neurone stabilisce un contato sinaptico con la terminazione assonale di un’altra cellula, può ridurre la quantità di neurotrasmettitori che quest’ultimo libererà su una terza cellula nervosa. Questo tipo di attività invece è detta inibizione presinaptica.

Analogamente una facilitazione presinaptica aumenterà la quantità di neurotrasmettitori liberato dalla cellula postsinaptica.

I casi d’inibizione e di facilitazione presinaptiche meglio analizzati sono quelli osservabili in talune cellule nervose d’invertebrati (gangli delle radici dorsali). In queste cellule sono stati messi in evidenza tre meccanismi d’inibizione presinaptica.

  1. chiusura dei canali Ca e contemporanea apertura dei canali K voltaggio dipendenti; entrambi questi processi determinano una riduzione d’ingresso di Ca ed una anticipata ripolarizzazione della cellula.
  2. Aumento della conduttanza verso il Cl che riduce l’ampiezza del il potenziale di azione nella terminazione presinaptica. Ciò determina una minore depolarizzazione e l’attivazione di un numero minore di canali Ca
  3. Inibizione diretta del processo di liberazione del neurotrasmettitore diminuendo la sensibilità verso i Ca

Al contrario la facilitazione presinaptica è dovuta ad un aumento di Ca. Nei neuroni di certi molluschi un neurotrasmettitore facilitante come la serotonina agisce tramite fosforilazione di AMPc-dipendente che determinano la chiusura di alcuni canali K prolungando l’ingresso di Ca.

Perciò la regolazione della concentrazione dei Ca liberi nella terminazioni presinaptica costituisce la base per una gamma di meccanismi che conferiscono plasticità alle sinapsi chimiche.

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Dott. S.Aboudan